На электрофореграмме контаминация проявляется как

На электрофореграмме контаминация проявляется как

Разделение растворенных белков под действием постоянного электрического поля носит название белкового электрофореза (ЭФ). В качестве носителя для проведения электрофореза могут быть использованы различные материалы, выбор которых зависит от поставленной задачи.

В настоящее время в диагностической практике в качестве поддерживающей среды используют ацетатцеллюлозную мембрану или гель агарозы (агароза отличается большей чувствительностью и лучшим разрешением, поэтому предпочтительна). Величина пор обоих этих носителей намного больше величины исследуемых молекул, в связи с чем даже высокомолекулярные белки мигрируют в них беспрепятственно.

В щелочной среде (именно в щелочном буфере проводят диагностический электрофорез) белки биологических жидкостей имеют суммарный отрицательный заряд. Под действием электрического поля они перемещаются к аноду со скоростью, зависящей главным образом от величины заряда. После окончания фореза пластину с разделенными образцами окрашивают специальными красителями, а затем полученные электрофореграм-мы оценивают визуально и с помощью приборов.
При использовании современного оборудования и готовых диагностических наборов получение электрофореграмм занимает обычно не больше 1 ч.

Электрофоретическое разделение нормальной сыворотки человека в геле агарозы позволяет выявить следующие фракции: преальбумин, альбумин и пять глобулиновых зон: а, (формируется в основном за счет а1-антитрипсина), а2 (ее образуют гаптоглобин и а2-макроглобулин), b1 (трансферрин), b2 (С3-компонент комплемента) и у (ее формирует в основном IgG). Если исследуют плазму, в быстрой у-зоне имеется дополнительно полоса фибриногена. Другие белки в норме содержатся в количествах, не позволяющих выявить их в виде отдельных зон, но при повышении их уровня могут давать дополнительные полосы в зоне своей миграции или приводить к усилению окраски уже существующих фракций. Это прежде всего орозомукоид и а-липопротеины (а,-зона), антихимотрипсин и церулоплазмин (а2-зона), фибронектин (граница а2- и b-зон), четвертый компонент комплемента — С4 (b-зона), С-реактивный белок и лизоцим (у-зона), поликлональные IgA (b2у1-зона) и IgM (у1-зона).

Электрофоретическое разделение плазмы здорового взрослого в геле агарозы.
1 — преальбумин; 2 — антихимотрипсин; 3 — церулоплазмин; 4 — фибронектин; 5 — С4 (4-й компонент комплемента); 6 — старт; 7 — С-реактивный белок; 8 — лизоцим; Альб. — альбумин; a1-Лп — а1-липопротеин; а1-Ат — а1,-антитрипсин; Ор— орозомукоид; a2-М — а2-макроглобулин; Гг2„, — гаптоглобин 2—2; р-Лп — р-липопротеин; Тф — трансферрин; Гп — гемо-пексин; C3 — 3-й компонент комплемента; Фб — фибриноген. Анод слева.

Поликлональные иммуноглобулины, характерной особенностью которых является гетерогенность структуры и, следовательно, заряда молекул, отличаются разной подвижностью в электрическом поле, поэтому область их миграции (у-зона) представляет собой широкое диффузное пятно без четких границ. Структурная гомогенность моноклональных иммуноглобулинов обусловливает гомогенность изоэлектрических точек молекул внутри пула. На электрофореграмме моноклональные иммуноглобулины образуют, как правило, узкую, четко ограниченную полосу, называемую М-градиентом.

Интенсивность окрашивания каждой из электрофоретических фракций пропорциональна количеству образовавшего ее белка: чем больше белковых молекул мигрирует в определенной зоне, тем больше красителя они связывают. Плотность окрашивания в каждой точке электрофореграммы оценивают с помощью специального прибора — денситометра, детектор которого регистрирует степень ослабления светового луча, перемещающегося вдоль трека перпендикулярно к поверхности последнего. Данные сканирования представляют в виде графика, на котором каждая белковая зона образует пик.

Высота пика отражает интенсивность окраски зоны, а ширина—степень ее гетерогенности. По площади пиков автоматически рассчитывают относительное (в процентах) и абсолютное (в весовых единицах) содержание белка в электрофоретических фракциях. Для расчета в весовых единицах необходимо предварительно ввести в прибор данные о концентрации общего белка в образце.

Качественно выполненный электрофорез является высокоинформативным методом. Он позволяет без больших затрат времени, сил и средств дать предварительную характеристику белков сыворотки и других биологических жидкостей.

Один из основных недостатков метода — неспецифичность, т. е. невозможность во многих случаях сделать вывод о природе белковой полосы, выявленной на электрофореграмме. Это относится прежде всего к дополнительным зонам и фракциям, отсутствующим в нормальной сыворотке. Кроме того, если электрофоретическая подвижность двух разных белков совпадает, то на электрофореграмме они образуют одну полосу. Поэтому в случаях, когда на основании клинико-лабораторного симптомокомплекса можно предполагать заболевание, характеризующееся белковой патологией, электрофоретическое исследование сыворотки недостаточно: необходимо использовать дополнительно иммунохимические методы.

Например, при дефиците IgA и IgM уровень электрофоретической у-фракции остается в пределах нормы, поскольку эта зона формируется в основном за счет IgG. Только иммунохимическое определение уровня иммуноглобулинов позволяет выявить иммунодефицитное состояние.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Источник

Контаминация лаборатории. Как проверить, одолеть и спать спокойно?

Контаминация – что это?

Контаминация – это проблема, о которой не всегда принято говорить, но которая существует и затрагивает все лаборатории, работающие с ПЦР. Контаминация происходит за счет загрязнения рабочих зон, оборудования и одежды сотрудников различными типами ДНК и РНК и приводит к ложноположительным результатам ПЦР. Это серьезная проблема для лабораторий любого профиля и критическая – для клинических и криминалистических организаций. Каждый год в PubMed появляется около 100 статей о проблеме ДНК-контаминации, однако публикаций о том, как с ней бороться, очень мало (рис. 1).

Главным образом, загрязнения попадают в воздух из пробирок, планшетов, с рук операторов, а затем переносятся по всей лаборатории и за ее пределы и оседают на одежде сотрудников, дверных ручках, холодильниках и других контактных предметах или остаются в воздухе в виде аэрозоля. Также контаминация может произойти при проведении некоторых лабораторных процедур, например при выделении ДНК из геля для клонирования или при автоклавировании. Среди основных типов контаминирущих ДНК и РНК можно выделить:

Чтобы контаминация лаборатории не стала причиной ошибочных результатов ПЦР, ее нужно своевременно выявить и ликвидировать.

Как проверить лабораторию на наличие контаминации?

Самый важный момент, который позволит вовремя выявить контаминацию, – это постановка отрицательных контролей. Если они не проходят, то первым делом нужно поменять реагенты и пластик и использовать другой ламинарный бокс для повторной постановки реакции. Если после этого отрицательные контроли проходят, следует провести локальную деконтаминацию изначального ламинарного бокса и утилизировать контаминированные реагенты. Однако если после смены пластика, реагентов и ламинарного бокса отрицательные контроли не проходят, значит произошла более серьезная контаминация: поверхностная или воздушная. Определение типа контаминации позволяет оценить сам масштаб необходимых мер: при контаминации воздуха необходима самая сложная – объемная – деконтаминация всего помещения.

Для анализа контаминации поверхностей нужно сделать с них смывы: нанести ПЦР-буфер на проверяемую поверхность и несколько раз ресуспендировать, а затем использовать полученный раствор в качестве матрицы для ПЦР. Чтобы проанализировать чистоту воздуха, необходимо сделать посевы из воздуха: открыть пробирку с ПЦР-буфером и подержать ее на воздухе полчаса, закрыть пробирку и использовать этот буфер в качестве ПЦР-матрицы. Если нет возможности проверить наличие ДНК в воздухе и сделать смывы с поверхностей для оценки их чистоты (например, негде поставить заведомо “чистые” реакции), следует сразу начинать деконтаминацию.

Что делать, если вы обнаружили контаминацию?

Если на каком-либо этапе проверки лаборатории на наличие контаминации вы все-таки ее выявили, то нужно с этой проблемой бороться. Советы от эксперта в области деконтаминации позволят вам грамотно и своевременно устранить контаминацию и не допустить ее повторного появления.

И помните, ни в коем случае нельзя пользоваться спиртом, он осаждает ДНК на поверхностях, но никогда ее не разрушает и осложняет ее смывку (как это характерно для любых осадков нуклеиновых кислот после спирта). При использовании 70% и 96%-этанола Cq сдвигается всего на 0.5-2 цикла – даже чистая вода обладает лучшими деконтаминационными свойствами. Также не надо надеяться на хлорку и перекись водорода. Эти средства не решат вашу проблему, и нужно пользоваться профессиональными средствами для ДНК-деконтаминации.

Компания «Биомедицинские инновации» разработала высокоэффективное средство DNArid для борьбы с этой проблемой. В таблице показано, насколько эффективен данный реагент по сравнению с аналогичными продуктами других производителей, а также насколько традиционные средства (хлорсодержащие дезинфицирующие средства и перекись водорода в различных концентрациях) уступают профессиональным.

Средство DNArid применяется как при уже случившейся контаминации, так и для ее предотвращения при еженедельной или ежедневной обработке рабочих зон и оборудования. Реагент не токсичен, безопасен для окружающей среды, не коррозивен и может применяться на любых поверхностях. Благодаря своей безопасности DNArid полностью решает проблему лабораторий, в которых помещения для ПЦР и электрофореза находятся не в разных зданиях или хотя бы не на разных этажах. Плановая обработка дверных ручек и других предметов (в том числе лабораторной одежды и обуви), с которыми контактируют операторы, снижает до нуля риск внесения контаминации в чистую зону.

После того, как деконтаминация проведена, нужно поставить отрицательные контроли, провести смывы с поверхностей и оценить качество воздуха, чтобы подтвердить, что деконтаминация прошла успешно. Когда вы убедились, что контаминация элиминирована, нужно минимизировать риски новой контаминации.

Что делать, чтобы предотвратить контаминацию?

Для того чтобы предотвратить контаминацию, важно действовать комплексно. Деконтаминации традиционными средствами или облучения ультрафиолетом недостаточно. Несколько простых правил и советов помогут вам избежать проблему ДНК-контаминации:

Подводя итог, можно отметить, что проблему контаминации возможно решить в достаточно короткие сроки, при этом важно действовать комплексно, применяя методы как химической, так и физической деконтаминации. Чтобы не допустить повторного появления контаминации, нужно руководствоваться несколькими простыми правилами работы в лаборатории, и тогда ложноположительные результаты не будут угрожать вашим экспериментам. Желаем вам новых открытий и продуктивной работы, в которой нет места контаминации!

Источник

На электрофореграмме контаминация проявляется как

Электрофорез сывороточных белков: современные возможности анализа

Гильманов А.Ж., д.м.н., профессор
Саляхова Р.М., к.м.н., доцент
Кафедра лабораторной диагностики ИПО Башкирского медуниверситета, г. Уфа

Информативность и экономичность – важнейшие требования к лабораторным исследованиям, которые приходится учитывать как в отечественной, так и в зарубежной практике. Одним из достаточно информативных лабораторных тестов, используемых в настоящее время, является электрофорез белков биологических жидкостей (сыворотка крови, моча, спинномозговая жидкость и др.), который позволяет получить значительную диагностическую информацию. К сожалению, в большинстве лабораторий нет необходимых приборов. В то же время часть лабораторий, имеющих оборудование для электрофореза, им зачастую не пользуется из-за поломок, отсутствия расходных материалов или, как нередко бывает, невостребованности этого типа анализов лечащими врачами вследствие их недостаточной осведомленности о современных возможностях и клинической значимости этого метода. Исследование белкового и липопротеинового спектра сыворотки крови особенно значимо для диагностики патологических состояний, сопровождающихся нарушениями обмена белков и дислипопротеидемиями. При многих заболеваниях в сыворотке крови изменяется соотношение отдельных белков (диспротеинемия), хотя общее содержание белка может остаться нормальным.

В настоящее время известно более 150 индивидуальных сывороточных белков; значительную часть из них можно количественно определить современными иммуноферментными, иммунохемилюминесцентными и иммунотурбидиметрическими методами. Но при всей информативности и доказательности таких анализов пока они в основном малодоступны из-за сравнительной дороговизны: себестоимость одного количественного определения апопротеинов, антитрипсина или иммуноглобулинов составляет от 2 до 8 долларов США. Вместе с тем типовые сдвиги белкового состава сыворотки крови можно определить гораздо более доступным электрофоретическим методом, который к тому же позволяет «одним взглядом» оценить общую картину белкового спектра и получить значимую диагностическую информацию.

С учетом приведенного выше, при интерпретации результатов клиницистам нет смысла придавать диагностическое значение, например, снижению содержания альбумина у пациента на 2-3% от справочных данных. Само понятие нормы в лабораторной практике весьма условно; нормальные значения параметров зависят от местных факторов и должны формироваться в первую очередь «на местной базе», т.е. в конкретной лаборатории при обследовании здорового контингента. Вместе с тем для общего контроля качества разделения белков выпускаются специальные контрольные сыворотки, которые желательно иметь в каждой лаборатории, работающей этим методом.

Для электрофореза белков используются различные аппараты, как ручные, так и полуавтоматические. Современные комплексы оснащены микропроцессорными блоками питания и управляются компьютером; в большинстве систем на последней стадии исследования окрашенных мембран или гелевых пластинок (определения относительного количества белков в каждой фракции) используется электронный цветной сканер или миниатюрная фотокамера, что существенно повышает точность и воспроизводимость результатов. Программное обеспечение дает возможность усредненного расчета оптической плотности отдельных фракций путем автоматического определения границ «дорожек» и многократного сканирования каждой из них в нескольких «разрезах», что позволяет исключить ошибки из-за локальных микродефектов и неровного положения носителя, а также до определенной степени нивелировать искривление дорожки и влияние окрашенного фона при неполной отмывке. На экран дисплея и на принтер выводится график-денситограмма с рассчитанным содержанием отдельных белковых фракций. При необходимости маркеры границ фракций на графике можно скорректировать, при этом будет произведен автоматический пересчет их показателей. В компьютере, как правило, создается архив электрофореграмм; их можно в любое время извлечь и просмотреть.

Электрофорез белков, позволяющий определить их количественные сдвиги и физико-химические характеристики, помогает выявить заболевания печени и почек, иммунной системы, некоторые злокачественные новообразования (лейкозы), острые и хронические инфекции, генетические поломки и др. Известен ряд своеобразных электрофоретических «синдромов» – типичных картин электрофореграмм, характерных для некоторых патологических состояний. Среди них можно отметить:

Ниже представлены примеры интерпретации данных исследования сыворотки крови нескольких пациентов, проведенного с помощью устройства электрофореза с анализатором электрофореграмм УЭФ-01-«Астра» производства НПЦ «Астра» (г. Уфа).

Электрофоретические методы в клинической лабораторной диагностике имеют хорошую перспективу. Так, среди новинок можно отметить автоматические системы капиллярного электрофореза, которые выполняют быстрое разделение биомолекул внутри капилляра под действием высокого напряжения; для таких приборов требуются уже не микролитры, а нанолитры образца. В целом использование современных электрофоретических анализаторов позволяет с высокой точностью и минимальными затратами исследовать широчайший спектр биохимических параметров с целью уточнения диагноза, мониторинга патологического процесса и обоснования методов терапии заболеваний.

Источник