Как выглядит кровь через микроскоп
Клинический анализ крови: от светового микроскопа к гематологическим анализаторам
Общий клинический анализ крови – это самый распространенный диагностический тест, который назначает пациенту врач. За последние десятилетия технология этого рутинного, но очень информативного исследования проделала колоссальный рывок – она стала автоматической. В помощь врачу лабораторной диагностики, орудием труда которого был обычный световой микроскоп, пришли высокотехнологичные автоматические гематологические анализаторы.
В этом посте мы расскажем, что именно происходит внутри «умной машины», видящей нашу кровь насквозь, и почему ей следует верить. Мы будем рассматривать физику процессов на примере гематологического анализатора UniCel DxH800 мирового бренда Beckman Coulter. Именно на этом оборудовании выполняются исследования, заказанные в сервисе лабораторной диагностики LAB4U.RU. Но для того, чтобы понять технологию автоматического анализа крови, мы разберемся с тем, что видели врачи-лаборанты под микроскопом и как они интерпретировали эту информацию.
Параметры анализа крови
Итак, в крови содержится три вида клеток:
При проведении общего анализа крови производят подсчет количества эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов. С лейкоцитами сложнее: их несколько видов, и каждый вид выполняет свою функцию. Выделяют 5 разных видов лейкоцитов:
Помимо количественных показателей, крайне важна морфология клеток. Изменение их обычной формы и размеров также свидетельствует о наличии определенных патологических процессов в организме.
Важный и наиболее известный показатель – количество в крови гемоглобина – сложного белка, обеспечивающего поступление кислорода к тканям и выведение углекислого газа. Концентрация гемоглобина в крови – главный показатель при диагностике анемий.
Еще один из важных параметров – это скорость оседания эритроцитов (СОЭ). При воспалительных процессах у эритроцитов появляется свойство слипаться друг с другом, образуя небольшие сгустки. Обладая большей массой, слипшиеся эритроциты под действием силы тяжести оседают быстрее, чем одиночные клетки. Изменение скорости их оседания в мм/ч является простым индикатором воспалительных процессов в организме.
Как было: скарификатор, пробирки и микроскоп
Вспомним, как раньше сдавали кровь: болезненный прокол подушечки скарификатором, бесконечные стеклянные трубочки, в которые собирали драгоценные капли выжатой крови. Как лаборант одним стёклышком проводил по другому, где находилась капля крови, царапая на стекле номер простым карандашом. И бесконечные пробирки с разными жидкостями. Сейчас это уже кажется какой-то алхимией.
Кровь брали именно из безымянного пальца, на что были вполне серьезные причины: анатомия этого пальца такова, что его травмирование дает минимальную угрозу сепсиса в случае инфицирования ранки. Забор крови из вены считался куда более опасным. Поэтому анализ венозной крови не был рутинным, а назначался по необходимости, и в основном в стационарах.
Стоит отметить, что уже на этапе забора начинались значительные погрешности. Например, разная толщина кожи дает разную глубину укола, вместе с кровью в пробирку попадала тканевая жидкость – отсюда изменение концентрации крови, кроме того, при давлении на палец клетки крови могли разрушаться.
Помните ряд пробирок, куда помещали собранную из пальца кровь? Для подсчета разных клеток действительно нужны были разные пробирки. Для эритроцитов – с физраствором, для лейкоцитов – с раствором уксусной кислоты, где эритроциты растворялись, для определения гемоглобина – с раствором соляной кислоты. Отдельный капилляр был для определения СОЭ. И на последнем этапе делался мазок на стекле для последующего подсчета лейкоцитарной формулы.
Анализ крови под микроскопом
Для подсчета клеток под микроскопом в лабораторной практике использовался специальный оптический прибор, предложенный еще в ХIX веке русским врачом, именем которого этот прибор и был назван – камера Горяева. Она позволяла определить количество клеток в заданном микрообъеме жидкости и представляла собой толстое предметное стекло с прямоугольным углублением (камерой). На нее была нанесена микроскопическая сетка. Сверху камера Горяева накрывалась тонким покровным стеклом.
Эта сетка состояла из 225 больших квадратов, 25 из которых были разделены на 16 малых квадратов. Эритроциты считались в маленьких исчерченных квадратах, расположенных по диагонали камеры Горяева. Причем существовало определенное правило подсчета клеток, которые лежат на границе квадрата. Расчет числа эритроцитов в литре крови осуществлялся по формуле, исходя из разведения крови и количества квадратов в сетке. После математических сокращений достаточно было посчитанное количество клеток в камере умножить на 10 в 12-й степени и внести в бланк анализа.
Лейкоциты считали здесь же, но использовали уже большие квадраты сетки, поскольку лейкоциты в тысячу раз больше, чем эритроциты. После подсчета лейкоцитов их количество умножали на 10 в 9-й степени и вносили в бланк. У опытного лаборанта подсчет клеток занимал в среднем 3-5 мин.
Методы подсчета тромбоцитов в камере Горяева были очень трудоемки из-за малой величины этого вида клеток. Оценивать их количество приходилось только на основе окрашенного мазка крови, и сам процесс был тоже весьма трудоемким. Поэтому, как правило, количество тромбоцитов рассчитывали только по специальному запросу врача.
Лейкоцитарную формулу, то есть процентный состав лейкоцитов каждого вида в общем их количестве мог определять только врач – по результатам изучения мазков крови на стеклах.
Визуально определяя находящиеся в поле зрения различные виды лейкоцитов по форме их ядра, врач считал клетки каждого вида и общее их количество. Насчитав 100 в совокупности, он получал требуемое процентное соотношение каждого вида клеток. Для упрощения подсчета использовались специальные счетчики с отдельными клавишами для каждого вида клеток.
Примечательно, что такой важный параметр, как гемоглобин, определялся лаборантом визуально (!) по цвету гемолизированной крови в пробирке с соляной кислотой. Метод был основан на превращении гемоглобина в солянокислый гематин коричневого цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию гемоглобина. Полученный раствор солянокислого гематина разводили водой до цвета стандарта, соответствующего известной концентрации гемоглобина. В общем, прошлый век
Как стало: вакуумные контейнеры и гематологические анализаторы
Начнем с того, что сейчас полностью поменялась технология забора крови. На смену скарификаторам и стеклянным капиллярам с пробирками пришли вакуумные контейнеры. Использующиеся теперь системы забора крови малотравматичны, процесс полностью унифицирован, что значительно сократило процент погрешностей на этом этапе. Вакуумные пробирки, содержащие консерванты и антикоагулянты, позволяют сохранять и транспортировать кровь от точки забора до лаборатории. Именно благодаря появлению новой технологии стало возможным сдавать анализы максимально удобно – в любое время, в любом месте.
На первый взгляд, автоматизировать такой сложный процесс, как идентификация клеток крови и их подсчет, кажется невозможно. Но, как обычно, все гениальное просто. В основе автоматического анализа крови лежат фундаментальные физические законы. Технология автоматического подсчета клеток была запатентована в далеком 1953 году американцами Джозефом и Уолессом Культерами. Именно их имя стоит в название мирового бренда гематологического оборудования Bеckman&Coulter.
Подсчет клеток
Апертурно-импедансный метод (метод Культера или кондуктометрический метод) основан на подсчете количества и оценке характера импульсов, возникающих при прохождении клетки через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два электрода. При прохождении клетки через канал, заполненный электролитом, возрастает сопротивление электрическому току. Каждое прохождение клетки сопровождается появлением электрического импульса. Чтобы выяснить, какова концентрация клеток, необходимо пропустить через канал определенный объем пробы и сосчитать количество появившихся импульсов. Единственное ограничение – концентрация пробы должна обеспечивать прохождение через апертуру только одной клетки в каждый момент времени.
За прошедшие более 60 лет технология автоматического гематологического анализа прошла большой путь. Вначале это были простые счетчики клеток, определяющие 8-10 параметров: количество эритроцитов (RBC), количество лейкоцитов (WBC), гемоглобин (Hb) и несколько расчетных. Такими были анализаторы первого класса.
Второй класс анализаторов определял уже до 20 различных параметров крови. Они существенно выше по уровню в дифференциации лейкоцитов и способны выделять популяции гранулоцитов (эозинофилы + нейтрофилы + базофилы), лимфоцитов и интегральной популяции средних клеток, куда относились моноциты, эозинофилы, базофилы и плазматические клетки. Такая дифференциация лейкоцитов успешно использовалась при обследовании практически здоровых людей.
Самыми технологичными и инновационными анализаторами на сегодняшний день являются машины третьего класса, определяющие до сотни различных параметров, проводящие развернутое дифференцирование клеток, в том числе по степени зрелости, анализирующие их морфологию и сигнализирующие врачу-лаборанту об обнаружении патологии. Машины третьего класса, как правило, снабжены еще и автоматическими системами приготовления мазков (включая их окраску) и вывода изображения на экран монитора. К таким передовым гематологическим системам относятся оборудование BeckmanCoulter, в частности система клеточного анализа UniCel DxH 800.
Современные аппараты BeckmanCoulter используют метод многопараметрической проточной цитометрии на основе запатентованной технологии VCS (Volume-Conductivity-Scatter). VCS-технология подразумевает оценку объема клетки, ее электропроводимость и светорассеяние.
Первый параметр – объем клетки – измеряется с использованием принципа Культера на основе оценки сопротивления при прохождении клеткой апертуры при постоянном токе. Величину и плотность клеточного ядра, а также ее внутренний состав определяют с помощью измерения ее электропроводности в переменном токе высокой частоты. Рассеяние лазерного света под разными углами позволяет получить информацию о структуре клеточной поверхности, гранулярности цитоплазмы и морфологии ядра клетки.
Полученные по трем каналам данные комбинируются и анализируются. В результате клетки распределяются по кластерам, включая разделение по степени зрелости эритроцитов и лейкоцитов (нейтрофилов). На основе полученных измерений этих трех размерностей определяется множество гематологических параметров – до 30 в диагностических целях, более 20 в исследовательских целях и более ста специфичных расчетных параметров для узкоспециализированных цитологических исследований. Данные визуализируются в 2D- и 3D-форматах. Врач-лаборант, работающий с гематологическим анализатором BackmanCoulter, видит результаты анализа на мониторе примерно в таком виде:
А далее принимает решение – надо ли их верифицировать или нет.
Стоит ли говорить, что информативность и точность современного автоматического анализа во много раз выше мануального? Производительность машин подобного класса – порядка сотни образцов в час при анализе тысяч клеток в образце. Вспомним, что при микроскопии мазка врачом анализировалось только 100 клеток!
Однако несмотря на эти впечатляющие результаты, именно микроскопия до сих пор пока остается «золотым стандартом» диагностики. В частности, при выявлении аппаратом патологической морфологии клеток образец анализируется под микроскопом вручную. При обследовании больных с гематологическими заболеваниями микроскопия окрашенного мазка крови проводится только вручную опытным врачом-гематологом. Именно так, вручную, дополнительно к автоматическому подсчету клеток, выполняется оценка лейкоцитарной формулы во всех детских анализах крови по заказам, сделанным с помощью лабораторного онлайн-сервиса LAB4U.RU.
Вместо резюме
Технологии автоматизированного гематологического анализа продолжают активно развиваться. По существу они уже заменили микроскопию при выполнении рутинных профилактических анализов, оставив ее для особо значимых ситуаций. Мы имеем в виду детские анализы, анализы людей, имеющих подтвержденные заболевания, особенно гематологические. Однако в обозримом будущем и на этом участке лабораторной диагностики врачи получат аппараты, способные самостоятельно выполнять морфологический анализ клеток с использованием нейронных сетей. Снизив нагрузку на врачей, они в то же время повысят требования к их квалификации, поскольку в зоне принятия решений человеком останутся только нетипичные и патологические состояния клеток.
Количество информативных параметров анализа крови, увеличившиеся многократно, поднимает требования к профессиональной квалификации и врача-клинициста, которому необходимо анализировать сочетания значений массы параметров в диагностических целях. На помощь врачам этого фронта идут экспертные системы, которые, используя данные анализатора, предоставляют рекомендации по дальнейшему обследованию пациента и выдают возможный диагноз. Такие системы уже представлены на лабораторном рынке. Но это уже тема отдельной статьи.
Клетки крови человека под микроскопом
Если вы рассмотрели все доступные предметы под микроскопом, то сейчас самое время усложнить технику наблюдения и расширить исследуемые объекты. С помощью прибора можно заглянуть в ту часть природы, из которой состоим мы. Рассмотрим, как выглядят наши клетки крови под микроскопом.
Чтобы исследовать кровь, используют разные методы окраски материала: по Романовскому-Гимзе (самый распространенный), по Маю-Грюнвальду, по Паппенгейму или по Райту. Окраска помогает выделить структуру клетки и способствует более детальному ее рассмотрению. Для этого нужно приобрести готовый красящий раствор или порошок, состоящий из азура и эозина. Они всегда есть в продаже в специализированных магазинах.
Исследуют кровь в домашних условиях с помощью светового микроскопа, используя разное увеличение. Например, при 150х можно рассмотреть множество мелких клеток.
При среднем увеличении от 400х – 600х различаются эритроциты и среди них лейкоциты.
Для более глубокого изучения используют увеличение от 1000х и более. В этом случае можно детально рассмотреть структуру каждой клетки.
Как выглядят клетки крови под микроскопом?
Наша кровь состоит из нескольких видов клеток, выполняющих три основные функции:
Эритроциты под микроскопом
Самая многочисленная группа круглых клеток — эритроциты. Глядя в микроскоп, вы их увидите сразу. Эритроциты переносят кислород ко всем клеткам организма и имеют розовый цвет.
Лейкоциты под микроскопом
Среди огромного количества эритроцитов вы увидите лейкоциты: лимфоциты, моноциты, базофилы, нейтрофилы и эозинофилы. Подробно их можно разглядеть при увеличении не менее 1000х. Лейкоциты защищают организм человека от различных заболеваний, вызванных вирусами, бактериями, грибками. В борьбе с ними многие лейкоциты погибают.
Тромбоциты под микроскопом
Тромбоциты отвечают за свертываемость крови. Это очень маленькие круглые клетки. Если у вас профессиональный микроскоп с увеличением больше 1000х, то вы их точно увидите.
Мы предоставили небольшой материал о том, как выглядят клетки крови человека под микроскопом с фото, но настоящее исследование с использованием собственного прибора этого не заменит. Если микроскопия станет вашим хобби, то вы откроете для себя потрясающие вещи! Например, вы когда-нибудь задумывались над тем, почему СОЭ (скорость оседания эритроцитов) выше нормы у больного человека? Рассмотрите воспаленную кровь и найдете ответ! Сколько удивительных открытий можно сделать прямо сейчас!
Здесь даже не нужно покупать очень сложное и дорогостоящее оборудование (пусть этим занимаются лаборатории!), но стоит задуматься о приобретении доступной оптической техники среднего класса. Такая покупка даст потрясающую возможность открыть для себя тайны микромира, не доступного нашему глазу!
Диагностика по крови: как это делается
Кровь была одной из первых жидкостей, которую любознательные медики поместили под только что изобретенный микроскоп. С тех пор прошло более 300 лет, микроскопы стали намного совершеннее, но глаза врачей по-прежнему смотрят на кровь в окуляры, выискивая признаки патологии.
На стекле
Антони ван Левенгук определенно получил бы несколько Нобелевских премий, живи он в наше время. Но в конце XVII века этой награды не было, поэтому Левенгук довольствуется всемирной известностью конструктора микроскопов и славой основателя научной микроскопии. Добившись в своих приборах 300-кратного увеличения, он сделал множество открытий, в том числе первым описал эритроциты.
Последователи Левенгука довели его детище до совершенства. Современные оптические микроскопы способны давать увеличение до 2000 раз и позволяют рассматривать прозрачные биологические объекты, включая клетки нашего организма.
Другой нидерландец — физик Фриц Цернике — в 1930-х годах заметил, что ускорение прохождения света по прямой делает изображение изучаемой модели более детальным, выделяя отдельные элементы на светлом фоне. Для создания интерференции в образце Цернике придумал систему колец, которые располагались как в объективе, так и в конденсаторе микроскопа. Если правильно настроить (юстировать) микроскоп, то волны, которые идут от источника света, будут попадать в глаз с определенным смещением по фазе. И это позволяет значительно улучшить изображение изучаемого объекта.
Метод получил название фазово-контрастной микроскопии и оказался настолько прогрессивным и перспективным для науки, что в 1953 году Цернике была присуждена Нобелевская премия по физике с формулировкой «За обоснование фазово-контрастного метода, особенно за изобретение фазово-контрастного микроскопа». Почему это открытие так высоко оценили? Раньше, чтобы рассмотреть под микроскопом ткани и микроорганизмы, их приходилось обрабатывать различными реактивами- фиксаторами и красителями. Живые клетки при таком раскладе увидеть не получалось, химикаты просто убивали их. Изобретение Цернике открыло в науке новое направление — прижизненное микроскопирование.
В XXI веке биологические и медицинские микроскопы стали цифровыми, способными работать в разных режимах — как в фазовом контрасте, так и в темном поле (изображение формируется светом, дифрагированным на объекте, и в результате объект выглядит очень светлым на темном фоне), а также в поляризованном свете, который нередко позволяет выявлять структуру объектов, лежащую за пределами обычного оптического разрешения.
Казалось бы, медикам нужно радоваться: в их руки попал мощнейший инструмент изучения тайн и загадок человеческого организма. Но этот высокотехнологичный метод очень заинтересовал не только серьезных ученых, но и шарлатанов и мошенников от медицины, которые посчитали фазово-контрастное и темнопольное микроскопирование очень удачным способом выуживания энных сумм денег у доверчивых граждан.
Она живая и шевелится
У пациента, который решится пройти обследование методом «Диагностика по живой капле крови» (варианты названия — «Тестирование на темнопольном микроскопе» или «Гемосканирование»), берут каплю крови, не окрашивают, не фиксируют, наносят на предметное стекло и изучают, просматривая образец на экране монитора. По результатам исследования ставятся диагнозы и назначается лечение.
Гемосканирование можно считать венцом творения мошеннической мысли, шедевром и высшим пилотажем околомедицинского шарлатанства. Во-первых, используется реально существующее физическое явление (про Нобелевку помните?) и самая настоящая сложная медицинская аппаратура. И действительно дорогостоящая. Стоимость диагностического комплекса обходится не менее чем в 3−4 тысячи долларов, и продают его солидные поставщики серьезной медицинской техники. Аппаратура имеет все необходимые — подлинные и совершенно заслуженные — сертификаты и свидетельства. Во-вторых, никаких проблем с лицензированием. Лабораторная диагностика — вполне законный вид медицинской деятельности, а микроскоп, позволяющий осуществлять фазово-контрастное или темнопольное микроскопирование, — вполне законная медицинская диагностическая аппаратура. Мало того, она широко применяется в медицине, то есть существуют сертифицированные и дипломированные специалисты. В-третьих, действительно под микроскопом можно обнаружить массу признаков тех или иных заболеваний. Например, изменение формы эритроцитов при серповидноклеточной анемии. А еще можно увидеть внутриклеточных паразитов все в тех же эритроцитах, бартонеллами называются. И даже яйца гельминтов в крови теоретически обнаружить можно.
Арба вижу — арба пою
Так в чем же подвох? В интерпретации. В том, как объясняют «темнопольщики» те или иные изменения в крови, как называют обнаруженные артефакты, какие диагнозы ставят и чем лечат. Разобраться в том, что это обман, сложно даже врачу. Нужна специальная подготовка, опыт работы с образцами крови, сотни просмотренных «стекол» — как крашеных, так и «живых». Как в обычном поле, так и в темном. К счастью, у автора статьи такой опыт имеется, как имеется он и у тех экспертов, с которыми сверялись результаты расследования.
Правильно говорится — лучше один раз увидеть. И своим глазам человек поверит куда быстрее, чем всем устным увещеваниям. На это и рассчитывают «лаборанты». К микроскопу подсоединен монитор, который отображает все, что видно в мазке. Вот вы лично когда последний раз видели собственные эритроциты? Вот то-то и оно. Интересно ведь. А пока завороженный посетитель любуется клетками родной любимой крови, «лаборант» начинает интерпретировать то, что он видит. Причем делает это по принципу акына: «Арба вижу- арба пою». Про какую «арбу» могут напеть шарлатаны, подробно читайте во врезке.
О каких страшных диагнозах вам могут напеть шарлатаны, и почему их слов не надо бояться, лучше пояснять на конкретных примерах. Фото взяты с сайтов, рекламирующих методику гемосканирования. Глистов гемосканеры находят практически у каждого пациента. Действительно, в крови можно обнаружить яйца и личинки некоторых гельминтов. Например, у шистосом есть период гематогенной диссеминации, то есть распространения по организму с током крови. Вот только в периферической крови их обнаружить невозможно, слишком маленький диаметр у капилляров пальца, откуда берут материал для анализа. Яйца имеют размеры 140-240 на 50-85 мкм. Средний размер эритроцита — 7,5 мкм. Вывод: ни яйцо, ни тем более личинка не могут быть размером с эритроцит. И даже с два эритроцита. А знаете, что на фото выделено красным кружком? Это эритроцит, который находится перпендикулярно к плоскости предметного стекла. Ведь каплю крови не размазывают по нему слоем ровно в одну клетку. Поэтому не все красные кровяные тельца смотрят «лицом» на исследователя. Кто-то в анфас, а кто-то и боком. Кстати, мембрана эритроцитов очень гибкая, именно поэтому они умудряются протиснуться даже в самые узкие капилляры. В нашем организме действительно образуются кристаллы. Чаще всего в моче, но иногда встречаются и в крови, например игольчатые кристаллы уратов (солей мочевой кислоты). Подпись к приведенному фото гласила «Кристаллы ортофосфорной кислоты». Вообще-то кристаллы настоящей ортофосфорной кислоты (точнее, ее полугидрата) бесцветны и гексагональны, и добиться такой концентрации в крови, чтобы она начала кристаллизоваться, нереально. Если в организме вдруг и будут образовываться кристаллы фосфорной кислоты, то они будут фосфатом кальция (из него и состоят фосфатные камни в почках и желчном пузыре). А то, что нам пытаются представить здесь под видом кристаллов ортофосфорной кислоты – самая обычная грязь на объективе микроскопа.
После того как пациент будет напуган и сбит с толку непонятными, а иногда и откровенно страшными картинками, ему объявляют «диагнозы». Чаще всего много, и один кошмарнее другого. Например, расскажут, что плазма крови инфицирована грибками или бактериями. Неважно, что увидеть их даже при таком увеличении достаточно проблематично, а уж отличить друг от друга- тем более. Микробиологам приходится сеять возбудителей различных болезней на специальные питательные среды, чтобы потом можно было точно сказать, кто вырос, к каким антибиотикам чувствителен Микроскопия в лабораторных исследованиях применяется, но либо со специфичными красителями, либо вообще с флуоресцирующими антителами, которые прикрепляются к бактериям и таким образом делают их видимыми.
Но даже если, чисто теоретически, в крови под микроскопом будет обнаружен такой гигант мира бактерий, как кишечная палочка (1−3 мкм длиной и 0,5−0,8 мкм шириной), это будет означать только одно: у пациента сепсис, заражение крови. И он должен лежать горизонтально с температурой под 40 и прочими признаками тяжелейшего состояния. Потому что в норме кровь стерильна. Это одна из основных биологических констант, которая проверяется достаточно просто- посевом крови на различные питательные среды.