Как выделяют чистую культуру анаэробов

Выделение чистой культуры анаэробных бактерий

Методы выделения чистых культур анаэробов.

· Метод Цейсслера. Исследуемый материал сеют штрихами по поверхности плотной среды. Создают анаэробные условия. И инкубируют при 37 градусах 24-72ч. Изолированные колонии анаэробов пересевают на среду контроля стерильности или среду Китта-Тароцци.

· Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материал вносят в пробирку с 4-5мл изотонического раствора. Перемешивают запаянным капилляром переносят в пробирку с охлажденным до 45-50 градусов сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания этим же капилляром засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают под струей воды. Выросшие в глубине колонии пересевают на СКС или среду Китта-Тароцци.

· Метод Перетца. Готовят разведение материала, как указано выше. Содержимое пробирки с соответствующим разведением выливают в чашку Петри, на дне которой на двух палочках лежит стеклянная пластина 6х6см. среду заливают так, что бы она заполнила пространство между пластиной и дном чашки. При появлении роста пластинку поднимают и чистые колонии пересевают.

5 МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР:

этапы выделения чистых культур аэробных бактерий:

В лабораторной практике часто придется работать с анаэробными микроорганизмами. Они более прихотливы к питательным средам, чем аэробы, чаще нуждаются в специальных ростовых добавках, требуют прекращения доступа кислорода при их культивировании, длительность роста их длиннее. Потому работа с ними более сложна, требует значительного внимания бактериологов и лаборантов.

Важной является защита материала, который содержит анаэробные возбудители от токсичного влияния атмосферного кислорода. Потому материал из очагов гнойной инфекции рекомендуется забирать во время их пункции с помощью шприца, время между взятием материала и посевом его на питательную среду должно быть максимально коротким.

Способствует снижению окислительно восстановительного потенциала введения в среду не меньше 0,05 % агару, который, увеличивая его вязкость, способствует уменьшению поступления кислорода. Это, в свою очередь, достигается еще и использованием свежих (не позже двух часов после изготовления) и редуцируемых питательных сред.

Следует учесть, что через особенности бродильного типа метаболизма анаэробных бактерий они требуют более богатых на питательные компоненты и витамины сред. Чаще всего используют сердечно мозговой и печеночный настои, соевые и дрожжевые экстракты, гидролитичний перевар казеина, пептон, триптон. Обязательным является добавление факторов росту, таких как твин-80, гемин, менадион, цельная или гемолизированная кровь.

Методы создания анаэробных условий. Учитывая, что свободный молекулярный кислород является токсичным для облигатно-анаэробных бактерий, обязательным условием культивирования таких микроорганизмов является ограничение его доступа. Существует ряд методов (механических, физических, биологических), которые позволяют это обеспечить.

Физические методы. 1. Перед посевом бактерий на питательную среду его обязательно регенерируют для удаления избытка растворенного кислорода. С этой целью среду кипятят в течение 15-20 мин на водяной бане, а затем быстро охлаждают к необходимой температуре.

2. Для предупреждения проникненя кислорода в среду его заливают слоем стерильного вазелинового масла или парафином.

3. Столбик питательной среды в пробирках должен быть достаточно высоким (10-12 см). Кислород, как правило,дифундирует в толщу столбика на глубину до 2 см, потому ниже создаются благоприятные условия для культивирования анаэробных микробов.

4. Эвакуационно заместительный метод заключается в использовании анаэростатов. Они представляют собой герметические металлические или пластмассовые банки, из которых можно выкачать кислород и заменить его инертным газом (гелий, азот, аргон). Допускается использование трехкомпонентной газовой смеси, которая состоит из 80 % азота, 10 % диоксиду углерода и 10 % водорода. Порой допустимым считается использование природного газа. Для поглощения кислорода, который остается в анаэростате, используют палладиевые катализаторы. С целью поглощения водяной пары используют хлорид кальция, силикагель и тому подобное, которые помещают на дно анаеростата.

Химические методы. 1. Использование веществ, способных поглощать кислород. С этой целью допустимым является применение щелочного раствора пирогаллола. При этом учитывают поглощающую активность вещества: на 100мл емкости герметического сосуда, в котором находятся чашки Петри, используют 1 г пирогаллола и 10 мл 2,5 N раствора гидроксида натрия.

Кислородосвязывающий эффект имеет также гидросульфит натрия (Na2S2O4). Для связывания кислорода в 1 лвоздуха используют смесь, которая состоит из 100 мл свежего 20 % раствору Na₂S₂O₄ и 16 мл 50 % гидроксида калия.

2. Применение веществ-редуцентов. Учитывая, что рост облигатно-анаэробных бактерий происходит в средах с низким уровнем окислительно восстановительного потенциала, к ним добавляются специальные восстановители:цистеин (0,03-0,0,5 %), тиогликолевую кислоту или тиогликолат натрия (0,01-0,02 %), сульфид натрия, аскорбиновую кислоту (0,1 %), разнообразные сахара.

Функции обновителей могут выполнять кусочки паренхиматозних органов животных (печенка, почки, сердце) или даже растений (картофель, другие корнеплоды).

Степень поглощения кислорода или степень возобновления среды измеряют или электрометрически или с помощью индикаторов (резазурин, нейтральный красный, феносафранин).

3. Использование специальных газогенерирующих систем, которые позволяют создать бескислородные условия вмикроанаеростатах, транспортных пластиковых пакетах и тому подобное. Одной из самых распространенных есть система “Gas Generating Box”. В ее состав входят химические генераторы водорода (борогидрит натрию) и углекислого газа (таблетки бикарбоната натрия и лимонной кислоты), а также палладиевый катализатор, который поглощает кислород.

Чашки с посевами помещаются в микроанаеростат, на дне которого находится слой палладиевого катализатору. Кончик пакета “Gas Generating Box” надрезают ножницами, и у него наливают 10-15 мл воды. Пакет располагают вмикроанаеростати. Через 15-20 мин в нем создаются анаэробные условия. Водород, который выделяется, взаимодействует с кислородом, образовывая воду, а углекислота продуцируется при взаимодействии бикарбоната натрия с лимонной кислотой.

Биологические методы. 1. Метод Фортнера. Метод заключается в совместном культивировании на одной средеаэробних и анаэробных микроорганизмов. Сначала по диаметру чашки вырезают полоску агару шириной до 0,5-1,0 см. С одной стороны засевают исследуемый материал, что содержит анаэробные возбудители, а из другого – микробы, которые являются индикатором анаэробных условий (Serratia marcescens или “чудесная палочка”). Края чашки парафинируют или закрывают пластилином. Через некоторое время на поверхности среды вырастают колонии какаэробных, так и анаэробных микробов. При поглощении кислорода Serratia marcescens дает рост бледно-розовых или бесцветных колоний, а при нарушениях герметичности – ярко-красные. На другой половине чашки вырастают колонии анаэробных микробов.

2. Метод Хеннеля (“часовых стекол”). Он является своеобразной модификацией предыдущего. Материал, который содержит анаэробные возбудители, засевается на поверхность питательной среды диаметром 2-2,5 см. Сверху он покрывается “часовым стеклом”, заполненным слоем МПА и засеяным Serratia marcescens. Аеробни микробы, поглощая кислород, создают условия для благоприятного роста анаэробных возбудителей.

В высоко специализированных лабораториях пользуются специальной анаэробной техникой, которая включает использование питательных сред без кислорода с обновителями, выполнения посевов и пересеваний в атмосфере инертных газов, углекислоты и тому подобное.

За последние годы созданы стационарные анаэробные боксы, которые содержат все необходимое для создания анаэробных условий культивирования, включая термостаты. Как правило, такие камеры заполняются трикомпонентноюгазовой смесью. Бактериолог работает в камере, находясь внешне, применяя резиновые рукавицы, вмонтированные у нее. Такое оборудование имеет неопровержимые преимущества, которые заключаются в том, что полностью исключается контакт кислорода с исследуемым материалом.

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

Источник

Методы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий.

Выделение чистых культур аэробов занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме:

Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на од­ной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из пер­вого сектора во второй и таким же образом последовательно в тре­тий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после су­точного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии.

Выделение чистых культур анаэробных бактерий:

Химические методы заключаются в том, что чашки с посевами ана­эробов ставят в герметически закрытый эксикатор, куда помещают хи­мические вещества, например, пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода.

Биологический метод основан на одновременном выращивании анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в чашках Пет­ри, герметически закрытых после посева. Вначале кислород погло­щается растущими аэробами, а затем начинается рост анаэробов.

Выделение чистой культуры анаэробов начинают с накопления анаэробных бактерий путем посева на среду Китта-Тароцци. В даль­нейшем получают изолированные колонии одним из двух способов:

1) посев материала производят путем смешивания с расплавленным теплым сахарным агаром в стеклянных трубках. После застывания ага­ра в глубине его вырастают изолированные колонии, которые извле­кают путем распила трубки и пересевают на среду Китта-Тароцци (спо­соб Вейнберга);

2) посев материала производят на чашки с питательной средой и инкубируют в анаэростате. Выросшие на чашке изолированные ко­лонии пересевают на среду Китта-Тароцци.

21) Вирусы (история открытия, характеристика).

Первооткрывателем вирусов, основоположником вирусологии яв­ляется русский ученый Дмитрий Иосифович Ивановский, открывший в 1892 году вирус табачной мозаики (ВТМ)

Особенности вирусов, отличающие их от всех других живых су­ществ:

2) отсутствие собственных белоксинтезирующих систем и клеточ­ного строения;

3) внутриклеточный паразитизм на молекулярном (генетическом) уровне.

Вирионы, содержащие только нуклеиновую кислоту и белок, сос­тавляют нуклеокапсид. Это простые вирусы, например, ВТМ, вирус полиомиелита.

Размножаясь в чувствительных клетках организма, вирусы оспы, бе­шенства, гриппа образуют в них внутриклеточные включения. Их мож­но обнаружить в световом или в люминесцентном микроскопе. Обна­ружение внутриклеточных включений используется для диагностики. Например, включения Бабеша-Негри в нервных клетках об­наруживаются при бешенстве.

Морфологию вирионов изучают в электронном микроскопе. Ви­русы имеют разные формы: сферическую, нитевидную, палочковидную.

Репродукция вирусов

Репродукция вируса в клетке происходит в несколько фаз:

В зависимости от типа нуклеиновой кислоты этот процесс совер­шается следующим образом.

ДНК-содержащие (ДНК —> иРНК —>белок)

2. Репродукция происходит в цитоплазме: вирусы имеют свою ДНК-зависимую РНК полимеразу. РНК-содержащие.

1. Рибовирусы с позитивным геномом (плюс-нитиевые): пикорна-, тога-, коронавирусы. Транскрипции нет. РНК —>белок

2. Рибовирусы с негативным геномом (минус- нитиевые): грипп,корь, паротит, орто-, парамиксовирусы.

Описанные типы взаимодействия вируса с клеткой называются продуктивными, так как приводят к продукции зрелых вирионов.

Источник

Этапы выделения чистой культуры анаэробных бактерий

Выделение чистых культур анаэробов изучаем на примере выделения C.perfringensиз раневого отделяемого при подозрении на газовую гангрену.

1-й этап. Обогащение на среде Китта–Тароци.

1.Приготовление мазков из раневого отделяемого и окраска по Граму. Под микроскопом видны крупные грамположительные палочки, часть которых окружены неокрасившейся капсулой (в виде белого ободка), что позволяет заподозрить газовую инфекцию.

2.Посев раневого отделяемого на среду Китта-Тароцци, предварительно прокипяченной в течении 30 минут. После посева среду прогревают 15 минут при 80°С для уничтожения вегетативных форм, споры анаэробов при этом сохраняются;

3.Инкубация посевов в термостате при 37 0 в течение 18-24 часов.

2-й этап. Получение изолированных колоний.

1.Изучение характера роста на среде Китта-Тароцци. При росте C.perfringensона мутнеет и в ней образуется газ (результат образования газа при ферментации глюкозы).

2.Приготовление мазка из бульонной культуры и окраска по Граму. Под микроскопом видны крупные грамположительные палочки.

3.Получение изолированных колоний анаэробов двумя способами:

— на поверхности твердой питательной среды (сахарно-кровяного агара) по Цейсслерув анаэробных условиях;

— в глубине среды Вильсон-Блера по Вейнбергу.

4.Инкубация посевов в термостате при 37 0 в течение 18-24 часов.

3-й этап. Выделение чистой культуры.

1.Макроскопическое изучение выросших колоний анаэробов:

а) на сахарно-кровяном агаре, обратить внимание на зону гемолиза вокруг колоний, что является признаком гемолитической активности бактерий (вирулентности);

б) в глубине среды Вильсон-Блера, обратить внимание на цвет колоний. Черные колонии образует C.perfringensза счет образования сульфата железа (FeS).

2.Приготовление из подозрительных колоний мазков и окрашивание их по Граму. Под микроскопом выявляются крупные грамположительные палочки;

3.Остаток колонии, подвергшейся микроскопическому изучению, отсевают на среду Китта-Тароцци для получения чистой культуры.

4.Инкубация посевов в термостате при 37 0 в течение 18-24 часов.

4-й этап.Идентификация выделенной чистой культуры анаэробов.

1.Макроскопическое определение роста культуры на среде Китта-Тароцци;

3.Окончательная идентификация выделенной чистой культуры анаэробов

проводится по токсигенности в реакции нейтрализации экзотоксина на белых мышах, биохимическим, антигенным свойствам и по генетической структуре.

5-й этап.Учет результатов идентификации и оформление заключения о виде.

Например, выделена чистая культура C.perfringens, идентификация проведена по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным, токсигенным свойствам и по генетической структуре.

Вирусологические методы

Для выделения и культивирования облигатных паразитов (вирусов, риккетсий и хламидий) применяются вирусологические методы: заражение тканевых культур, куриного эмбриона и восприимчивых лабораторных животных. Вирусологическое исследование проводится в два этапа: выделение вируса и идентификация вируса. Материалами для вирусологического исследования могут быть отделяемое носоглотки, испражнения, кровь и другие материалы в зависимости от локализации вируса. Вирусологические методы также применяются для культивирования некоторых факультативных паразитов, например, микоплазмы, бруцелл, франциселл, легионелл и др.

Заражение куриного эмбриона в аллантоисную полостьс целью

выделения чистой культуры вируса гриппа и идентификации.

1-й этап.Выделение вируса (культивирование вируса).

Для заражения используют куриные эмбрионы 8-14 дневного возраста.

1) перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона в овоскопе и отмечают карандашом на скорлупе границы воздушной камеры;

2) яйцо помещают на подставку в вертикальном положении так, чтобы воздушный мешок находился наверху;

3)стерилизация скорлупы на тупом конце яйца в такой последовательности: спиртом, 2 % йодной настойкой ещё раз спиртом и обжиганием;

4) над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы;

5) Пастеровской пипеткой вводят 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2-3 мм ниже границы воздушной камеры;

6) отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем;

7) инкубация эмбриоа в термостате в течение 2-3 суток при 37 0 С.

2-й этап.Идентификация выделенной чистой культуры вируса.

1) яйцо устанавливают на подставке так, чтобы воздушное пространство было наверху;

2) обработка скорлупы последовательно спиртом, йодом, опять спиртом и обжиганием;

3) осторожно снимают лейкопластырь, рассекают и сбрасывают скорлупу, определяют гибель эмбриона, отсасывают аллантоисную жидкость и разливают в пробирки;

4) идентификация вируса проводится по гемагглютинирующей активности (по способности склеивать куриных эритроцитов) в реакции гемагглютинации.

Реакция гемагглютинации (РГА)

Применяется для идентификация вирусов по гемагглютинирующей активности. Вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами (имеющие гемагглютинин – гликопротеид суперкапсида), способны гемагглютинировать эритроцитов различных животных. Например, вирусы гриппа – куриных эритроцитов.

1) исследуемый материал – аллантоисная жидкость(гемагглютинин вируса гриппа?);

2) 5% суспензия куриных эритроцитов;

3) физиологический раствор.

Существует два способа постановки реакции: капельный способ на стекле и объемный способ в пробирке.

Капельный способ на стекле:

Опыт:1 капля аллантоисной жидкости + 1 капля 5% суспензии куриных эритроцитов.

Контроль: 1 капля физ. раствора + 1 капля 5% суспензии куриных эритроцитов. Хорошо перемешать сначала контрольную каплю, затем- опытную.

Наличие гемагглютинации (выпадение хлопьев красного цвет) в опыте при ее отсутствии в контроле (гомогенное покраснение) указывает на содержание вируса гриппа в исследуемом материале. Гемагглютинация – это склеивание эритроцитов под влиянием гемагглютинина вируса. Вид вируса гриппа (А,В,С) дифференцируют по антигенной структуре с помощью РСК, ИФА, а серотип – РТГА (практические навыки 9.7). Окончательную идентификацию также можно провести по генетической структуре (ПЦР).

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).

Источник

Этапы выделения чистых культур анаэробов

Выделение чистых культур анаэробов имеет особенности, проводят в течение четырех дней.

Первый день: 1. Посев исследуемого материала на среду Китт-Тароцци или на среду RCM в пробирки. Среды предварительно должны быть выдержаны на кипящей водяной бане в течение 30 мин, для удаления кислорода.

Второй день: 1. Бактериоскопия выращенной культуры, если в мазках крупные палочки, исследования продолжают.

2. Посев культуры, выросшей на средах КиттТароцци или RCM по Цейсслеру на три чашки с кровяным, сахарным агаром (МПА с 5% крови и 1% глюкозы). Посев выполняют бактериологической петлей штрихами, ставят в анаэростат, откачивают воздух, потом в термостат. Можно сделать посев по Вейнбергу на три столбика с сахарным агаром, предварительно агар в столбиках выдерживают на кипящей водяной бане 30 мин, затем охлаждают до 37-40 0 С. Столбики после посева ставят в термостат.

Третий день: 1. Изучают характер роста, отмечают «типичные колонии».

2. Проводят бактериоскопию «типичных колоний», если морфологические свойства соответствуют предполагаемым микроорганизмам, исследования продолжают.

3. Посев «типичных колоний» на среду Китт-Тароцци или на среду RCM.

Четвертый день: 1. Бактериоскопия выросшей культуры, если в мазках одинаковые клетки – культура чистая, приступают к определению ее вида, идентификации. Идентификацию анаэробных микроорганизмов проводят по тем же свойствам, как и аэробных. Важное значение имеет результат биопробы.

Вопросы для обсуждения

1. Коллоквиум №1 по разделу «Общая микробиология».

Вопросы коллоквиума 1

1. Систематика микроорганизмов.

2. Систематика грибов.

3. Характеристика грибов и микозов.

4. Этапы приготовления мазка.

5. Характеристика палочковидных.

6. Разновидности кокков.

7. Характеристика извитых.

8. Характеристика риккетсий.

9. Характеристика хламидий.

10. Характеристика микоплазм.

11. L –формы бактерий, прото-, сферопласты.

12. Характеристика актиномицетов.

13. Структура бактериальной клетки.

14. Сложные методы окрашивания.

15. Техника и сущность окраски по Граму.

16. Способы размножения микроорганизмов.

17. Проницаемость и транспорт питательных веществ в клетки микроорганизмов.

18. Химический состав бактериальной клетки.

19. Типы питания бактерий.

20. Токсины микроорганизмов.

22. Питательные среды.

22. Культивирование бактерий, определения: чистая культура, смешанная культура, штамм, клон.

23. Типы дыхания бактерий.

24. Спиртовое и молочнокислое брожения.

25. Пропионовокислое, маслянокислое и ацетонобутиловое брожения.

26. Культуральные свойства бактерий.

27. Фазы роста микроорганизмов.

28. Выделение чистых культур аэробов.

29. Методы идентификации.

30. Выделение чистых культур анаэробов.

31. Мутации у микроорганизмов. 32. Рекомбинации у микроорганизмов.

ТЕМА 5 Методы стерилизации. Химические противомикробные препараты. Методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП и фагам

Цель занятия. Коллоквиум по разделу «Общая микробиология». Разобрать методы стерилизации, познакомиться с оборудованием для стерилизации. Разобрать и познакомиться с образцами химических противомикробных препаратов.

Разобрать и освоить методы определения микроорганизмов к антибиотикам, их распределения по группам на основе химической структуры и клинического применения. Познакомиться с методами определения чувствительности возбудителей к фагам.

Оборудование и материалы. Оборудование и инструменты для стерилизации. Образцы химических противомикробных препаратов.

Образцы антибиотиков и бактериофагов. Посевы ДДМ готовые к учету, Посев по методу серийных разведений, готовый к учету, чашки со средой АГВ, стерильные пипетки, бульонная культура, диски с антибиотиками. Образцы бактериофагов, посевы по методу Отто, Фюрта, Аппельмана, Грация готовые к учету

Задание для самостоятельной работы студентов. 1. Познакомиться с оборудованием для стерилизации. 2. Познакомиться с химическими противомикробными препаратами и распределить представленные в таблице образцы по группам назначения. 3.Освоить постановку и учета метода ДДМ, распределить образцы антибиотикам по группам на основе химической структуры и клинического применения.2. Познакомиться с образцами фагов и методами определения чувствительности возбудителей к бактериофагам.

Источник

Выделение чистой культуры аэробов и анаэробов

Методы выделения чистых культур микроорганизмов

Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной сре­ды, зависит от физических и химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболиз­ма каждой группы бактерий. Существуют методы культивирования мик­роорганизмов на твердых и в жидких питательных средах в аэробных, анаэробных и других условиях.

Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов. Для того, чтобы получить изолированные колонии, при нанесении материал распределяют так, чтобы клетки бактерий были удалены друг от друга. Для получения чистой культуры используют две основные группы методов:

а) мето­ды, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов;

б) методы, основанные на биологиче­ских свойствах микроорганизмов.

Методы, основанные на принципе механического разде­ления микроорганизмов

Рассев шпателем по Дригальскому. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят кап­лю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель пе­реносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпа­тель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом про­изводят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й — минимальное. В зависимо­сти от содержания микробных клеток в исследуемом ма­териале на одной из чашек вырастают отдельные коло­нии, пригодные для выделения чистой культуры микро­организма.

Метод Пастера (метод разведений). Из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных серийных разведений в жидкой стерильной среде или физиологическом растворе в пробирках. Далее высевают материал газоном по 0,5 мл из каждой пробирки. Предполагают, что в какой-то из пробирок останется количество микроорганизмов, поддающихся подсчету при высеве на пластинчатые среды. Этот метод дает возможность подсчитать микробное число в исследуемом материале. (Микробное число — количество колоний на последней чашке с ростом микроорганизмов, умноженное на степень разведения материала).

Рассев петлей (посев штрихами). Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый ма­териал петлей вносят в первый сектор и проводят ею па­раллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии. Кроме того, можно наливать разведен­ные растворы смешанной культуры на поверхность твер­дых сред в чашках.

Метод фильтрации. Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержа­щихся микроорганизмов по величине. Этот метод при­меняется главным образом для очистки вирусов от бак­терий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате — чистый фаг, очищенный токсин).

Методы, основанные на биологических свойствах мик­роорганизмов

Создание оптимальных условий для размножения

Метод Пастера (метод предельных разведений).Заключается в том, что из исследуемого материала делают ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде. Для этого каплю посевного материала вносят в пробирку со стерильной жидкой средой, из нее каплю переносят в следующую пробирку и так засевают до 8…10 пробирок. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться и можно получить такое разведение, в котором во всей пробирке со средой будет находиться только одна микробная клетка, из которой разовьется чистая культура микроорганизма.

Так как в жидких средах микробы растут диффузно, т.е. легко распределяются во всей среде, то изолировать одну микробную клетку от другой трудно. Таким образом, метод Пастера не всегда обеспечивает получение чистой культуры. Поэтому в настоящее время этот метод используется, главным образом, для предварительного уменьшения концентрации микроорганизмов в материале перед посевом его в плотную среду для получения изолированных колоний.

Методы механического разделения микроорганизмов с использованием плотных питательных сред.К таким методам относятся метод Коха и метод Дригальского.

Метод Коха (метод глубинного посева).

Исследуемый материал вносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой в пробирку с расплавленной плотной питательной средой. Равномерно размешивают содержимое пробирки, вращая ее между ладонями. Каплю разведенного материала переносят во вторую пробирку, из второй – в третью и т.д. Содержимое каждой пробирки, начиная с первой, выливают в стерильные чашки Петри. После застывания среды в чашках, их помещают в термостат для культивирования.

Для выделения анаэробных микроорганизмов по методу Коха необходимо ограничить доступ кислорода к культуре.

С этой целью поверхность глубинного посева в чашке Петри заливают стерильной смесью парафина и вазелина (1:1). Можно также оставлять посевной материал, тщательно перемешанный с агаризованной средой, непосредственно в пробирке.

Ватную пробку при этом заменяют резиновой или заливают поверхность агара смесью парафина и вазелинового масла. Чтобы извлечь выросшие колонии анаэробных микроорганизмов, пробирки слегка нагревают, быстро вращая над пламенем горелки. Агар, прилегающий к стенкам, расплавляется, и столбик легко выскальзывает в подготовленную чашку Петри. Далее столбик с агаром разрезают стерильным скальпелем, колонии извлекают стерильной петлей или стерильной капиллярной рубкой и переносят в жидкую среду.

Метод Дригальского основан на механическом разделении микробных клеток на поверхности плотной питательной среды в чашках Петри.

Каждая микробная клетка, фиксируясь в определенном месте, начинает размножаться, образуя колонию.

Для посева по методу Дригальского используют несколько чашек Петри, залитых плотной питательной средой.

На поверхность среды вносят каплю исследуемого материала.

Затем с помощью стерильного шпателя эту каплю распределяют по всей питательной среде (посев газоном).

Посев также можно проводить штрихом, используя бактериологическую петлю. Этим же шпателем или петлей осуществляют посев во вторую, третью и т.д. чашки. Как правило, в первой чашке после культивирования посева появляется рост микробов в виде сплошного налета, в последующих чашках содержание микроорганизмов снижается и образуются изолированные колонии, из которых отсевом можно легко выделить чистую культуру.

Таким образом, в первых секторах получается сплошной рост, а вдоль последующих штрихов вырастут обособленные колонии, представляющие собой потомство одной клетки.

В целях экономии сред и посуды можно пользоваться одной чашкой, разделив ее на сектора, и последовательно засевать их штрихом (метод истощающего штриха).

Для этого материал берут петлей и проводят ею ряд параллельных штрихов сначала по поверхности первого сектора, а затем последовательно оставшимися на петле клетками засевают все другие сектора.

При каждом последующем штрихе происходит уменьшение количества засеваемых клеток.

Метод выделения чистых культур с помощью химических веществ используется при изолировании культур микроорганизмов, устойчивых к определенным химическим веществам.

Например, с помощью этого метода можно выделить чистую культуру туберкулезных микобактерий, устойчивых к действию кислот, щелочей и спирта. В этом случае исследуемый материал перед посевом заливают 15 % раствором кислоты или антиформином и выдерживают в термостате в течение 3…4 часов.

После воздействия кислоты или щелочи клетки туберкулезной палочки остаются живыми, а все другие микроорганизмы, содержащиеся в исследуемом материале, погибают. После нейтрализации кислоты или щелочи обработанный материал высевают на плотную среду и получают изолированные колонии возбудителя туберкулеза.

Биологические методы выделения чистых культур патогенных микроорганизмов основаны на заражении исследуемым материалом лабораторных животных, восприимчивых к данному виду возбудителя.

Если патогенный микроорганизм содержится в исследуемом объекте, то лабораторное животное заболевает и погибает. После вскрытия павшего животного из внутренних органов делают посевы на специальные среды, на которых вырастают чистые культуры выделяемых микробов.

Выделение чистой культуры бактерий

Чистой называют культуру, содержащую микроорганизмы одного вида и полученную как потомство одной клетки. Чистые культуры можно получить из исходной микробной клетки, изолиро­ванной при помощи микроманипулятора, или из изолированных колоний путем их пересева в отдельные пробирки с питательной средой.

Для выделения чистой культуры используют следующие методы.

1. Метод Дригалъского.При этом методе расплавленную питательную среду разливают в 3 чашки Петри. В первую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и сте­рильным шпателем распределяют его по поверхности питательной среды. Затем шпатель переносят во вторую и далее в третью чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал.

При посеве этим методом на второй и на третьей чашках вырастают изолированные колонии. Полученные отдельные колонии пересевают в пробирки с питательной средой для получения чистой культуры микроорганизма.

2. Метод параллельных штрихов.При этом способе материал с помощью бактериологической петли распределяют по поверхности агара параллельными штрихами в одном направлении.

Затем, повернув чашку на 90°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посева материал, находящийся в петле, расходу­ется постепенно, и по линиям штрихов, нанесенных в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.

3. Метод Коха (метод рассева в глубине среды).При этом методе в пробирку с агаром, расплавленным и остуженным до 43-45°С, вносят одну бактериологическую петлю исследуемого материала и тщательно перемешивают.

После этого из этой пробирки одну петлю материала переносят во вторую пробирку, а затем из нее – в третью пробирку. Приготовленные разведения бактерий выливают из пробирок в стериль­ные чашки Петри. После застывания среды чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.

Контрольные вопросы по теме занятия:

1. Характер роста бактерий в жидких, на полужидких и плотных питательных средах.

2. Характеристика колоний микроорганизмов.

3. Пигменты бактерий и их роль для микроорганизмов.

4. методы выделения чистых культур бактерий.

Литература для подготовки к занятию:

Основная литература:

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А.Воробьева. М., 2004.

Дополнительная литература:

1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.

2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология.М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.

3. Медицинская микробиология. Справочник. Под ред. В.И. Покровского и О.К. Поздеева. М., ГЭОТАР-МЕД, 1998.

ЗАНЯТИЕ 5

ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Ферменты бактерий. Изучение ферментативной активности микроорганизмов. Дыхание бактерий. Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Ознакомиться с ферментами бактерий.

Изучить методы определения ферментативной активности микроорганизмов. Ознакомиться с процессами дыхания бактерий. Изучить методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ:

1. Ознакомиться с ферментами бактерий.

2. Изучить методы определения ферментативной активности микроорганизмов.

3. Ознакомиться с процессами дыхания бактерий.

4. Изучить методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

Ферменты бактерий

Все биохимические процессы в клетке микро­организмов, связанные с метаболизмом, ростом и размножением, совершаются при участии ферментов (энзимов).

Ферменты синтезируются самой микробной клеткой, и имеют сложное строение. Они представляют собой либо только белок с высокой молекулярной массой (трипсин, пепсин и др.), либо состоят из белка (апофермента), связанного с кофактором (коферментом). Кофермент может быть низкомолекулярным неорганическим (металл) или органическим ве­ществом.

Классификация ферментов основана на типах реакций, которые они катализируют.

Все ферменты делятся на шесть классов:

1). Оксидоредуктазы — ферменты переноса электронов. Эти ферменты катализируют окис­лительно-восстановительные реакции. К ним отно­сятся дегидрогеназы (НАД, НАДФ, ФАД), каталаза, цитохромы.

2).Трансферазы — ферменты переноса групп между молекулами от одних соединений к другим. К ним относятся ацетилтрансфераза, фосфотрансфераза, аминотрансфераза.

3). Гидролазы — ферменты переноса функциональных групп с участием воды. К этому классу ферментов относятся пептидгидролазы, глюкозидаза, амилазы, эстеразы, липаза, фосфатаза.

4). Лиазы — ферменты, отщепляющие или присоединяющие без участия воды различные соединения с двойной связью.

К этим ферментам относятся пируватдекарбоксилаза, альдолаза.

5). Изомеразы — ферменты, переносящие группы внутри молекул с образованием изомерных форм. К этим ферментам относятся триизофосфатизомераза, глюкозофосфатизомераза.

6). Лигазы (синтетазы) — ферменты, объединяющие две молекулы с одновременным разрывом фосфатных связей с использованием энергии АТФ. К лигазам относятся ферменты, катализирующие синтез сложных органических веществ из простых соединений (аспарагинсинтетаза, кокарбоксилазы).

Активность ферментов измеряют в международных еди­ницах (ME). 1 ME соответствует количеству ферментов, пре­вращающему один микромоль субстрата в 1 минуту в стандарт­ных условиях.

У бактерий различают эндоферменты и экзоферменты.

Эндоферменты находятся внутри бактериальной клетки, катализиру­ют внутриклеточные процессы обмена веществ. Экзоферменты выделяются во вне­шнюю среду и выполняют функцию расщепления сложных питательных веществ.

Ферменты агрессии. У патогенных бактерий имеется особая группа экзоферментов, которые называются ферментами агрессии. Они выполняют функции облегчения проникновения и распространения бактерий в тканях организма хозяина и ослабления его защитных свойств.

К ферментам агрессии относятся: гиалуронидаза, нейраминидаза, коллагеназа, протеазы, фибринолизин, гемолизин, лейкоцидин.

Конститутивные и индуцибельные ферменты. Ферменты, которые синтезируются клеткой с постоянной скоростью, независимо от наличия субстрата в среде называются конститутивными. Индуцибельные (адаптивные) ферменты образуются только в присутствии соответствующего субстрата в сре­де.

Например, фермент бета-галактозидазаначинает синтезироваться только при добавлении в питательную среду углевода лактозы, которую этот фермент расщепляет с образованием глюкозы и галактозы.

Методы определения ферментативной активности микробов

Обязательным условием идентификации выделенной чистой культуры бактерий является определение ферментативной активности в отношении углеводов и белков (биохимический «паспорт» вида).

Для выявления ферментов, расщепляющих углеводы (сахаролитические ферменты) используют дифференциально-диагностические среды Гисса.

В состав сред Гисса входит пептонная вода, индикатор рН, поплавок для улавливания газа и один из углеводов (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит, сахароза, крахмал и т.д.). Если бактерии расщепляют углевод, то образуется кислота и при этом меняется цвет среды за счет находящегося в ней индикатора рН. Большинство патогенных бактерий расщепляют углеводы с образованием только кислоты; некоторые виды ферментируют углеводы с образование кислоты и газа (СО2).

При этом меняется цвет среды и в поплавке появляется пузырек газа.

Протеолитическая активность бактерий. Показателями глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода. Для выявления этих газообразных веществ делают посевы чистой культуры бактерий на мясо-пептонный бульон или пептонную воду в пробирки со специальными бумажными индикаторами.

При наличии продуктов расщепления меняется цвет соответствующего индикатора.

Протеолитическую активность бактерий определяют также путем посева чистой культуры уколом в столбик желатина по наличию и характеру разжижения среды, например, в виде перевернутой елочки, гвоздя, воронки и т.д.

Энергетический метаболизм

Это совокупность биохимических реакций, результатом которых является образование (накопление энергии) и расщепление (расход энергии) макроэргических связей в молекулах АТФ.

У бактерий АТФ может синтезироваться в результате процессов брожения и дыхания.

Брожение. Более древний, низкоэффективный способ получения энергии, при котором в результате расщепления молекулы глюкозы образуется 2 молекулы АТФ. Конечными продуктами брожения являются СО2, вода, спирты и органические кислоты.

Процесс происходит без участия кислорода.

Дыханием называют процесс окислительного фосфорилирования углеводов с образованием молекул АТФ, СО2 и воды. При распаде одной молекулы глюкозы высвобождаются 12 электронов, которые проходят через цепь дыхательных ферментов, отдавая энергию для синтеза 36 молекул АТФ. Освобождение дыхательной цепи от электронов осуществляют вещества, называемые акцепторами электронов.

К таким веществам относится кислород, сульфаты, нитраты, карбонаты. Если конечным акцептором электронов служит мо­лекулярный кислород, дыхание называют аэробным. В случае конечной акцепции электронов другими соединениями дыхание называют анаэробным.

По типу дыхания бактерии классифицируют на че­тыре основные группы:

1. Облигатные (строгие) аэробырастут при свободном доступе кислорода (возбудитель ту­беркулеза).

Микроаэрофилы растут при низкой (до 1%) концентрации кислорода и повышенной концентрации углекислого газа (гемофильная палочка).

Факультативные анаэробы могут расти как в присутствии кислорода, так и в анаэробных условиях (кишечная палочка).

4. Облигатные (строгие) анаэробы могут расти только при пол­ном отсутствии кислорода в окружающей среде (возбудители столбняка, ботулизма, газовой гангрены).

Выделение чистых культур микроорганизмов

Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бактерий – обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной диагностике инфекционных болезней, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и, в целом, при любой работе с микроорганизмами.

Исследуемый материал (гной, мокрота, фекалии, кровь и другой материал от больных; вода, почва, воздух, пищевые продукты, трупы животных и человека, переносчики) обычно содержит ассоциации микробов.

Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, то есть производится его идентификация.

Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп.

Метод Пастера – последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение).

2. Метод Коха («пластинчатые разводки») – последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (температура 48-500С), с последующим разливом в чашки Петри, где агар застывает.

Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений, где бактерий становится мало и, в дальнейшем, при росте на чашках Петри появляются изолированные колонии, образующиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пересевом на свежие среды.

Метод Шукевича – применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара. Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу на месте посева.

Пересевая верхние края культуры можно получить чистую культуру.

4. Метод Дригальского – широко применяется в бактериологической практике, при этом исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим раствором или бульоном.

Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках. С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга.

Через 1-7 сут выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.

5. Метод Вейнберга. Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов.

Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского, но после этого чашки сразу помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведения исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-500С агаризированной питательной среде. Делают 6-10 последовательных разведений, затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной среды.

Иногда питательную среду после посева и перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают. При удачном разведении в пробирках, трубках Бурри, пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов.

Чтобы изолированные колонии хорошо были видны, используют осветленные питательные среды. Для извлечения изолированных колоний анаэробов, пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар, прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика выскальзывает в стерильную чашку Петри.

Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов (например, среду Китта-Тароцци). Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.

6. Метод Хангейта – когда хотят получить изолированные колонии бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (строгие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта.

Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку, среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.

Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор – прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля».

В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов.

Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток.

Методы выделения чистых культур аэробных бактерий

Механического разобщения Биологические

Метод Пастера Метод Коха Биологический Физический

(имеет историческое (пластинчатых

значение) разводок) Химический Метод Щукевича

Современные

Посев петлей Посев шпателем

Методы выделения чистых культур (схема 11):

Методы механического разобщения основаны на разъединении микробов путем последовательного растирания исследуемого материа­ла по поверхности агара.

а) Метод Пастера – имеет историческое значение, предусматривает последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде методом переката

б) Метод Коха – метод пластинчатых разводок – основан на последовательном разведении исследуемого материала мясо-пептонным агаром с последующей разливкой пробирок с разведенным материалом в чашки Петри

в) Метод Дригальского – при посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой, используют 2–3 чашки для последовательного посева шпателем.

г) Посев петлей параллельными штрихами.

Биологические методы основаны на биологических свойствах возбудителей.

а) Биологический – заражение высокочувствительных животных, где микробы быстро размножаются и накапливаются.

В одних случаях, этот метод является единственным, позволяющим вы­делить культуру возбудителя от больного человека (например, при туляремии),в других случаях – он более чувствителен (например, выделение пневмококка на белых мышах или воз­будителя туберкулеза на морских свинках).

б) Химический – основан на кислотоустойчивости микобактерий. Для освобождения материала от сопутствующей флоры, его
обрабатывают раствором кислоты.

Вырастут только туберкулезные палочки, так как кислотоподатливые микробы погибли под действием кислоты.

в) Физический метод основан на устойчивости спор к нагреванию. Для выделения культуры спорообразующих бактерий из
смеси материал прогревают при 80°С и засевают на питательную среду. Вырастут только споровые бактерии, так как споры их остались живыми и дали рост.

г) Метод Щукевича – основан на высокой подвижности вуль­гарного протея, способного давать ползучий рост.

Методика пересева из колоний на скошенный агар и МПБ:

а) Пересев из колоний на скошенный агар

Приоткрывают крышку чашки, прокаленной остуженной петлей снимают часть отдельной колонии, открывают пробирку со стерильным скошенным агаром, держа ее в левой руке в наклонном положении, так, чтобы можно было наблюдать поверхность среды.

Переносят петлю с культурой в пробирку, не прикасаясь к стенкам, растирают по питательной среде, скользя по поверхности от одного края пробирки к другому, поднимая штрихи до верхушки среды – посев штрихом. Пробирку закрывают и, не выпуская из рук, подписывают название посеянного микроба и дату посева.

б) Пересев из колонии на мясо-пептонный бульон

Техника пересева на МПБ в основном такая же, как и при посеве на плотную среду.

При посеве на МПБ петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый стерильной пастеровской или градуированной пипеткой, вливают в питательную среду.

В результате самостоятельной работы студент должен знать:

1.Методы выделения чистой культуры микроорганизмов

2. Методы культивирования микроорганизмов

Уметь:

1. Навыки соблюдения правил противоэпидемического режима и техники безопасности

2. Обеззараживать материал, проводить обработку рук

3. Приготовить препараты из колоний бактерий

Источник